Среда «Лимфокар-2», 60 мл, ПЭТ-тара
Среда "Лимфокар-2” по ТУ 20.59.52-016-45171785-2016
Представляет собой готовую к использованию бессывороточную среду, в состав которой входят все необходимые вещества для культивирования лимфоцитов цельной крови: смесь неорганических солей, аминокислот, витаминов, глюкозы, фенолового красного, антибиотиков, а также ФГА-П и др. Среда простерилизована методом мембранной фильтрации с размером пор 0,22 мкм.
Препарат: Прозрачная жидкость красно-розового цвета.
Назначение: Среда используется для культивирования лимфоцитов крови in vitro с целью получения делящихся клеток и последующего анализа метафазных хромосом. Анализ осуществляется с помощью микрометода культивирования лимфоцитов периферической крови человека и приготовления препаратов метафазных хромосом. Для анализа используется гепаринизированная кровь. Наличие в среде фитогемагглютинина-П (ФГА-П) в оптимальной для лимфоцитов человека концентрации обеспечивает митогенный эффект среды. Остановка митотического деления с последующим накоплением метафазных пластин достигается инкубацией клеток с колхицином. В дальнейшем для проведения цитогенетического анализа клетки переводят в гипотонический раствор хлористого калия, фиксируют смесью метанола с ледяной уксусной кислотой.
Способ применения:
Непосредственно перед применением среду следует разморозить. Размораживание должно происходить естественным путём в холодильной камере при температуре +2…+8 °С. Запрещена ускоренная разморозка среды, рекомендуется избегать многократных циклов замораживания-оттаивания.
Подготовка образца
- Все манипуляции проводить в асептических условиях. Содержимое флакона перемешать путём бережного переворачивания;
- В стерильную ёмкость (объёмом не менее 10 мл) внести 7 мл среды;
- Добавить 0,5 мл цельной гепаринизированной крови;
- Инкубировать при 37 °C в течение 72 часов.
Остановка деления клеток
- Приготовить раствор колхицина (0,1 мг/мл), растворив 0,1 мг в 5 мл дистиллированной воды. За 1,5–2 часа до окончания инкубации добавить по 50 мкл раствора в каждую ёмкость;
- Через 1,5–2 часа встряхнуть содержимое и перенести его в центрифужные пробирки;
- Центрифугировать в течение 5–7 мин. при 1000–1500 об/мин.
Гипотоническая обработка
- Приготовить 0,075 М раствор KCl (0,56 г на 100 мл дистиллированной воды) и подогреть до 37 °C;
- После центрифугирования удалить супернатант, разбить осадок. Добавить 10 мл подогретого раствора KCl, тщательно перемешать;
- Инкубировать при 37 °C в течение 10–12 мин.;
- Повторно центрифугировать 5–7 минут при 1000–1500 об/мин;
- Удалить супернатант, оставить 0,5–1,0 мл надосадочной жидкости;
- Энергично встряхнуть для ресуспендирования клеток.
Фиксация клеток (первичная)
- Добавить 2–3 мл свежеприготовленного фиксирующего раствора (метанол : уксусная кислота = 3:1);
- Довести объём до 6–8 мл, разбить осадок;
- Поместить пробирку в холодильник на 5–10 мин.;
- Центрифугировать 5–7 мин. при 1000–1500 об/мин., удалить супернатант;
- Добавить 8–10 мл охлаждённого фиксирующего раствора, разбить осадок;
- Выдержать при 4 °C в течение 15–20 мин.
Фиксация клеток (повторная)
- Центрифугировать 5–7 мин. при 1000–1500 об/мин., удалить супернатант;
- Добавить 2–3 мл фиксирующего раствора, довести объём до 6–8 мл, разбить осадок;
- Поместить пробирку в холодильник до момента окрашивания;
- Повторно центрифугировать 5–7 мин. при 1000–1500 об/мин., удалить супернатант;
- Ресуспендировать осадок в 0,5–1,0 мл фиксирующего раствора.
Приготовление препаратов
- Нанести суспензию на охлаждённые, смоченные водой предметные стёкла;
- Зафиксировать препараты, быстро проведя стёкла над пламенем или высушив при комнатной температуре.
Условия хранения: Хранить при температуре –10...–20 °С в защищённом от света месте. После вскрытия флакона хранить при температуре +2…+8 °С не более 1 месяца.
